【導讀】流式細胞術被臨床醫(yī)生和診斷醫(yī)生廣泛用于分析細胞特性。他們用光學方法逐一評估每個細胞的蛋白質(zhì)含量、血液健康狀況、粒度和細胞大小等屬性。盡管系統(tǒng)靈敏度高，但流式細胞儀的設計人員一直面臨著需要加速分析的壓力，這就要求采用新的方法設計流式細胞術及其相關電子元件。
本文將簡要介紹流式細胞術系統(tǒng)的工作原理。然后介紹 Analog Devices 的 18 位 ADC 模塊 ADAQ23878，并展示如何利用該模塊來設計流式細胞儀的檢測和轉(zhuǎn)換階段。此外，本文還將介紹一個可用于評估流式細胞術前端設計的評估套件。希望通過本文，讀者能夠更好地了解流式細胞術的高效數(shù)據(jù)采集解決方案。
流式細胞術被臨床醫(yī)生和診斷醫(yī)生廣泛用于分析細胞特性。他們用光學方法逐一評估每個細胞的蛋白質(zhì)含量、血液健康狀況、粒度和細胞大小等屬性。盡管系統(tǒng)靈敏度高，但流式細胞儀的設計人員一直面臨著需要加速分析的壓力，這就要求采用新的方法設計流式細胞術及其相關電子元件。
流式細胞儀對各個細胞進行激光照射，產(chǎn)生散射和熒光信號。為了快速、準確地捕捉所產(chǎn)生的光線并將其轉(zhuǎn)換為數(shù)字信號，需要一個雪崩光電二極管 (APD) 和復雜的電子元件。要設計和實現(xiàn)這個過程的電路可能需要很長時間，特別是考慮到流式細胞術數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)需要高速、低噪音的設備來確保系統(tǒng)的準確性。
為了實現(xiàn)更快的流式細胞術分析并保證成本效益，設計人員可以通過由內(nèi)部放大器驅(qū)動器和模數(shù)轉(zhuǎn)換器 (ADC) 組成的數(shù)據(jù)采集解決方案解決速度和準確性問題。
現(xiàn)代流式細胞術原理
現(xiàn)代流式細胞術是一個自動化過程，可以分析細胞和表面分子，描述并定義異質(zhì)細胞群中的不同細胞類型。不算準備時間（可能超過一個小時），該儀器能在不到一分鐘的時間里對 10000 個單細胞進行三到六個特征評估。為了實現(xiàn)這一點，流式細胞術的單細胞制備步驟至關重要。樣品在鞘液中組織，以流體力學方式將細胞或顆粒聚焦到狹長的單細胞列樣品流中，以進行分析。在經(jīng)過這種轉(zhuǎn)換后，單細胞必須保持其自然的生物特征和生化成分。圖 1 是流式細胞術儀的示意圖，首先從頂部加入多細胞樣品。
圖 1：流式細胞儀示意圖，從鞘液聚焦到數(shù)據(jù)采集。（圖片來源：Wikipedia，由 Bonnie Baker 修改）
流式細胞儀包含六個主要組件：流通池、激光器、雪崩光電二極管 (APD)、跨阻放大器 (TIA)、ADC，以及用于數(shù)據(jù)收集和分析的計算機。流式細胞儀有液流或鞘液，這兩者會收窄，以將細胞排列成單列送過光束。激光每次捕獲一個細胞，產(chǎn)生前向角散射光 (FSC) 信號和側(cè)向角散射光 (SSC) 信號。熒光通過鏡子和過濾器進行分類，然后由 APD 進行放大。接下來，在產(chǎn)生的光輸出擊中 APD 后對其進行檢測、數(shù)字化和分析。對于檢測來說，Analog Devices 的 LTC6268 500 兆赫 (MHz) 超低偏置電流、低電壓噪聲 FET 輸入運算放大器對于檢測所需的高速 TIA 是理想選擇。
圖 2：TIA 電路使用一個 APD (PD1) 和一個低輸入電流的 FET 運算放大器，將超低的光電二極管電流轉(zhuǎn)換成 IN1+ 的輸出電壓。（圖片來源：Bonnie Baker）
設計此放大器電路時，必須盡可能地擴大帶寬，因而必須盡量減少寄生電容。例如，寄生反饋電容 C 影響了圖 2 的電路穩(wěn)定性和帶寬。無論選擇何種電阻器封裝，在放大器的反饋路徑中總會存在寄生電容。但是，0805 封裝端蓋間距較長，寄生電容最低，是高速應用的首選。增加 R1 端蓋之間的距離并不是減少電容的唯一方法。另一種減少板對板電容的方法是在電阻 R1 下增設一條接地線，來屏蔽產(chǎn)生寄生電容的電場路徑（圖 3）。
圖 3：在反饋電阻下增設接地線，可從反饋端分流電場，并將傾泄至地面。（圖片來源：Analog Devices）
在這種情況下，該方法具體涉及到在靠近 TIA 輸出端的電阻墊下面和之間放置一條短的接地線。此方法可讓寄生電容達到 0.028皮法拉 (pF)，TIA 帶寬達到 1/(2π*RF*CPARASITIC)，相當于 11.4 MHz。光信號會導向幾個帶有適當濾光片的雪崩二極管。APD、TIA 和 ADC 系統(tǒng)將這些信號轉(zhuǎn)換為其數(shù)字表示，并將數(shù)據(jù)發(fā)送到微處理器做進一步分析。現(xiàn)代細胞儀通常配備多個激光器和 APD。目前的商用設備有 10 個激光器和 30 個雪崩光電二極管。增加激光和光電倍增管檢測器的數(shù)量，可以進行多次抗體標記，從而通過表型標記精確識別目標細胞群。
鞘液流速
流體力學聚焦過程形成單細胞列的能力
隧道直徑
保持細胞完整性的能力
流式細胞術聲波聚焦
雖然增加多個激光器和 APD 可以加速分析和識別，但在最好的情況下，最新的現(xiàn)代單細胞流式細胞術每分鐘可以收集多達一百萬個細胞的數(shù)據(jù)。在許多應用中，如檢測血液中低至每毫升 100 個的循環(huán)腫瘤細胞時，這種處理遠遠不夠。在罕見細胞的臨床應用中，試驗經(jīng)常需要對數(shù)十億的細胞進行分析，非常耗時。聲波聚焦過程是流體力學聚焦細胞制備過程的替代方案。在該過程中，將一種壓電材料（如鋯鈦酸鉛 (PZT)）附著在玻璃毛細管上，使電脈沖轉(zhuǎn)換成機械振動（圖 4a）。通過使用 PZT 在矩形流通池的共振頻率下振動玻璃毛細管的側(cè)壁，系統(tǒng)會產(chǎn)生具有不同數(shù)量壓力節(jié)點的各種聲駐波。
圖 4：矩形玻璃毛細管制成的聲學流通池示意圖 (a)。定寬毛細管的前三個壓力節(jié)點的位置 (b)。（圖片來源：美國國家生物技術信息中心）
這些 PZT 頻率節(jié)點將流動的粒子排列成多條離散的流線（圖 4b）。聲學流通池使用線性聲駐波，通過產(chǎn)生單次或多次諧波來調(diào)諧為各種波長。正如簡單線性駐波模型所預測的那樣，樣品中的細胞在流通池中產(chǎn)生單個或多個單細胞列。借助這種精確的細胞組織，鞘液隧道的寬度可以擴大，以加速流過激光束（圖 5）。
圖 5：對于流體力學樣品流（c.和 d.），隨著鞘液寬度增加，細胞樣品發(fā)生散射，使光學測量過程變得困難。無論鞘液寬度如何，聲波聚焦的樣品流（a.和 b.）都保持單列細胞。（圖片來源：Thermo Fischer Scientific）
傳統(tǒng)的流體力學聚焦（圖 5c.）將單細胞排成列，準備進行激光掃描。雖然樣品流核心的漏斗越寬，鞘液材料的速度就越快（圖 5d.），但這也會導致單細胞列發(fā)生分散，從而產(chǎn)生信號變化并影響數(shù)據(jù)質(zhì)量。聲波聚焦（圖5a.）將生物細胞和其他顆粒緊密地排列在一起，即使隧道較寬也沒有問題。這種精確的細胞排列允許更高的采樣率，同時保持數(shù)據(jù)質(zhì)量（圖 5b.）。在實踐中，流式細胞術聲波聚焦可使細胞采樣頻率提高約 20 倍（圖 6）。
圖 6：基于流體流式細胞術（A、B、C）與聲波聚焦細胞術 (D) 對比的各種流式細胞術設備采樣時間比較。（圖片來源：Thermo Fischer Scientific）
在圖 6 中，A、B 和 C 的設備采用流體力學技術，而 D 則采用聲波聚焦流式細胞術方法。
聲波聚焦流式細胞術數(shù)據(jù)采集
聲波聚焦流式細胞術設備的電子元件設計需要高速光敏電子元件，以適應血液細胞和鞘液通過較大直徑噴嘴的速度。前面提到的 600 MHz 高速 LTC6268 與專門的 0805 電阻封裝布局相結合，使光感應速率高達 11.4 MHz（圖 7 左）。LTC6268 的輸出被送入Analog Devices ADAQ23878 ADC 進行數(shù)字化。
圖 7：ADAQ23878 ADC 將光電二極管 (PD1) 和 TIA 電路（左）的光信號數(shù)字化。（圖片來源：Bonnie Baker）
ADAQ23878 是一款 18 位、每秒 15 兆次采樣 (MSPS) 的精密高速系統(tǒng)級封裝 (SIP) 數(shù)據(jù)采集解決方案。它將設計人員所面對的輸入驅(qū)動元器件選擇、優(yōu)化和布局等設計挑戰(zhàn)轉(zhuǎn)移至設備，從而極大地縮短了精密測量系統(tǒng)的開發(fā)周期。
這種 SIP 的模塊化方法通過將多個通用信號處理和調(diào)節(jié)模塊與高速、18 位、15 MSPS 逐次逼近寄存器 (SAR) ADC 組合在一個設備中，減少了終端系統(tǒng)的元器件數(shù)量。這些模塊包含一個低噪聲、全差分 ADC 激勵放大器和一個穩(wěn)定的參考緩沖器。
ADAQ23878 還集成了關鍵的無源元器件，它們采用 Analog Devices 的iPassive 技術，可最大限度地減少與溫度有關的誤差源并優(yōu)化性能。ADC 快速建立的驅(qū)動級有助于其確?？焖贁?shù)據(jù)采集。
為了評估 ADAQ23878，Analog Devices 提供了 EVAL-ADAQ23878FMCZ 評估板（圖 8）。該評估板可展示 ADAQ23878 μModule 的性能，是用于評估流式細胞術前端設計和其他各種應用的一款多功能工具。
圖 8：用于 ADAQ23878 的 EVAL-ADAQ23878FMCZ 評估板板載電路，配備用于控制和數(shù)據(jù)分析的關聯(lián)軟件，并且兼容 SDP-H1。（圖片來源：Analog Devices）
EVAL-ADAQ23878FMCZ 評估板需要一臺運行 Windows 10 或更高版本的個人計算機、一個低噪聲的精密信號源以及一個適合 18位測試的帶通濾波器。該評估板需要 ADAQ23878 ACE 插件和 SPD-H1 驅(qū)動器。
雖然使用標準的流體力學聚焦流式細胞術逐一檢查生物細胞已取得成功，但由于需要加快分析速度，人們開始轉(zhuǎn)而改用以聲波聚焦流式為主的方法。因此，若要支持更先進的流式細胞術，電子元件也必須改進，同時盡量縮小空間、節(jié)約成本并縮短開發(fā)時間。如本文所述，LTC6268 高速運算放大器可與 ADAQ233878 精密、高速、μModule 數(shù)據(jù)采集解決方案相結合，為先進的流式細胞術設備建立完整的數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)，從而保證快速的數(shù)據(jù)采集。
(作者：Bonnie Baker，來源：DigiKey得捷）
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